今(jin)天(tian)小編給大家(jia)簡述一下流(liu)式細胞儀檢測的(de)工作(zuo)原理，希望對您的(de)實驗工作(zuo)有(you)所幫助！

儀器設(she)備(bei)：

在流(liu)式細胞(bao)(bao)術(shu)中(zhong)使用(yong)的儀(yi)(yi)器(qi)(qi)稱為(wei)流(liu)式細胞(bao)(bao)分析儀(yi)(yi)，通常(chang)縮寫為(wei)“細胞(bao)(bao)分析儀(yi)(yi)"。流(liu)式細胞(bao)(bao)分析儀(yi)(yi)由一(yi)(yi)個用(yong)于進行(xing)細胞(bao)(bao)處理的流(liu)體系統(tong)和(he)一(yi)(yi)個包(bao)括數據采集信號檢測器(qi)(qi)和(he)處理器(qi)(qi)的光學系統(tong)組(zu)(zu)成。專為(wei) FACS 設計的儀(yi)(yi)器(qi)(qi)還包(bao)含一(yi)(yi)個細胞(bao)(bao)分選(xuan)組(zu)(zu)件(jian)，該組(zu)(zu)件(jian)可(ke)將細胞(bao)(bao)引(yin)導到不同(tong)的捕(bu)獲容器(qi)(qi)中(zhong)。

流體(ti)(ti)(ti)系統(tong)設計用于生成單細胞(bao)的(de)(de)(de)均勻流，以確保當細胞(bao)被用于檢測的(de)(de)(de)光(guang)源照射時，能夠進行(xing)適(shi)當分(fen)析。這通過使(shi)用加壓管將細胞(bao)從樣品(pin)管注入流室(shi)中(zhong)來完成。從容器（通常是一(yi)(yi)根試管或一(yi)(yi)塊多孔板）中(zhong)抽取細胞(bao)樣品(pin)，并將其注入流動液體(ti)(ti)(ti)（稱為鞘液）層流中(zhong)間的(de)(de)(de)流室(shi)中(zhong)。通過一(yi)(yi)個(ge)稱為流體(ti)(ti)(ti)動力學聚焦的(de)(de)(de)流程，鞘液(ye)可幫助縮(suo)窄細胞(bao)流，從而將細胞(bao)組織成一行(xing)大致單行(xing)的流線。

流(liu)式細胞分析儀的(de)光(guang)(guang)學系統包(bao)括照明源、過濾器(qi)、透鏡和收(shou)集光(guang)(guang)學器(qi)件。照明源常包(bao)括 1 個(ge)或多個(ge)激光(guang)(guang)束，且(qie)每個(ge)激光(guang)(guang)器(qi)發射的(de)光(guang)(guang)波長不同(tong)。檢測(ce)器(qi)不區分各種光(guang)(guang)波長，而是(shi)通(tong)過放置在光(guang)(guang)路徑中(zhong)的(de)過濾器(qi)來將光(guang)(guang)限(xian)制在所需波長范圍內。

相關試劑：

   為了通過流(liu)式細(xi)胞術分(fen)(fen)析特定靶標，對細(xi)胞組分(fen)(fen)進行熒(ying)光(guang)標記(ji)。這可(ke)以通過使用單獨的熒(ying)光(guang)分(fen)(fen)子（例如，細(xi)胞染料）或熒(ying)光(guang)團標記(ji)的抗體(ti)（直(zhi)接偶聯抗體(ti)或使用偶聯二抗）來完成。

1.流式細胞術中抗體的使用(yong)

抗(kang)(kang)體(ti)是(shi)許(xu)多(duo)生物(wu)檢(jian)測中(zhong)的(de)(de)關鍵(jian)工(gong)具(ju)，在流(liu)式細胞(bao)術中(zhong)也不(bu)例外。抗(kang)(kang)體(ti)具(ju)有特(te)(te)異性(xing)結合單(dan)個蛋白或(huo)蛋白修飾的(de)(de)能力(li)，并且可(ke)(ke)作為一種(zhong)方法來(lai)標記(ji)那些用于進行檢(jian)測的(de)(de)靶(ba)標。通過標記(ji)目(mu)的(de)(de)靶(ba)標，研究人員可(ke)(ke)以(yi)評估各種(zhong)細胞(bao)類(lei)型(xing)、疾病狀態、治療條(tiao)件、發(fa)育(yu)階(jie)段或(huo)其他生物(wu)模(mo)型(xing)中(zhong)蛋白的(de)(de)豐度或(huo)活(huo)性(xing)。與不(bu)同(tong)蛋白結合的(de)(de)抗(kang)(kang)體(ti)不(bu)會相互干擾，因此，可(ke)(ke)以(yi)使用多(duo)種(zhong)抗(kang)(kang)體(ti)同(tong)時檢(jian)測多(duo)個靶(ba)標。這稱為多(duo)重分析。抗(kang)(kang)體(ti)數量(liang)的(de)(de)限制是(shi)獨(du)立于其他抗(kang)(kang)體(ti)測定每種(zhong)抗(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)能力(li)。在流(liu)式細胞(bao)術中(zhong)，這種(zhong)差分測定使用稱為熒光(guang)團的(de)(de)熒光(guang)分子來(lai)完成。成功的(de)(de)實驗要求具(ju)有高度特(te)(te)異性(xing)和經驗證的(de)(de)抗(kang)(kang)體(ti)以(yi)及(ji)可(ke)(ke)靠的(de)(de)熒光(guang)團。

2.流式(shi)細胞術中熒光團的使用

熒(ying)光(guang)團(tuan)的共同特(te)性(xing)是能(neng)夠發射(she)與用于(yu)照(zhao)亮染料的光(guang)相(xiang)比波長(chang)更長(chang)的光(guang)。例如，如果使用藍色激光(guang)器來(lai)照(zhao)亮稱為綠(lv)色熒(ying)光(guang)蛋白 (GFP) 的分子(zi)，那么蛋白會吸(xi)收藍光(guang)并(bing)發射(she)綠(lv)光(guang)。被吸(xi)收的光(guang)與被發射(she)的光(guang)之間(jian)的波長(chang)差異稱為斯托克(ke)斯位移。

就是(shi)這種位移讓人們能(neng)夠準確定量(liang)來(lai)自熒光(guang)團的(de)(de)光(guang)，因為它能(neng)夠過濾(lv)來(lai)自激發源(yuan)的(de)(de)光(guang)的(de)(de)波長。激發源(yuan)總是(shi)比從正在分析的(de)(de)熒光(guang)團中發射的(de)(de)熒光(guang)更亮些，并且如果這種光(guang)無(wu)法移除(chu)，那么它將(jiang)會強烈影響(xiang)檢測器(qi)。

熒(ying)光(guang)染料(liao)吸(xi)收的(de)(de)光(guang)的(de)(de)范圍(wei)稱(cheng)(cheng)為“激(ji)發"光(guang)譜，而激(ji)發時其發出的(de)(de)熒(ying)光(guang)稱(cheng)(cheng)為“發射"光(guang)譜。激(ji)發和發射光(guang)譜針(zhen)對所(suo)有(you)常見染料(liao)提供，并呈曲線顯示(shi)各(ge)波(bo)長下吸(xi)收或(huo)發射的(de)(de)光(guang)量(liang)。

3.偶聯(lian)抗體

通常(chang)，在(zai)(zai)流式細(xi)胞(bao)(bao)術實驗中用(yong)于獲取讀(du)數的(de)(de)熒光(guang)(guang)(guang)團(tuan)會與抗體(ti)共價結(jie)合(he)。該過(guo)程(cheng)稱為(wei)偶(ou)聯，并(bing)且該抗體(ti)-熒光(guang)(guang)(guang)團(tuan)配對(dui)稱為(wei)偶(ou)聯物(wu)。當在(zai)(zai)一(yi)項(xiang)細(xi)胞(bao)(bao)檢測中使用(yong)偶(ou)聯抗體(ti)時，熒光(guang)(guang)(guang)團(tuan)發射(she)的(de)(de)光(guang)(guang)(guang)可(ke)作(zuo)為(wei)細(xi)胞(bao)(bao)內(nei)或細(xi)胞(bao)(bao)上存在(zai)(zai)的(de)(de)抗體(ti)量(liang)的(de)(de)一(yi)個直(zhi)接(jie)指標。（由于細(xi)胞(bao)(bao)膜是透光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)，細(xi)胞(bao)(bao)內(nei)熒光(guang)(guang)(guang)團(tuan)發射(she)的(de)(de)光(guang)(guang)(guang)不會顯著衰減。）通過(guo)使用(yong)特(te)異性結(jie)合(he)蛋白或蛋白修飾的(de)(de)偶(ou)聯物(wu)，研究人員可(ke)以根據每個細(xi)胞(bao)(bao)發射(she)的(de)(de)熒光(guang)(guang)(guang)水平(ping)，直(zhi)接(jie)量(liang)化(hua)該細(xi)胞(bao)(bao)中的(de)(de)目的(de)(de)靶標。該過(guo)程(cheng)稱為(wei)直(zhi)接(jie)檢測或直(zhi)接(jie)流式細(xi)胞(bao)(bao)術。

流(liu)式細胞術的(de)直接與間接染(ran)色(se)

直(zhi)(zhi)接：直(zhi)(zhi)接偶聯抗體

可直接多重分析來(lai)自(zi)同一宿主(zhu)的抗體

由于孵育和洗滌步驟更少，因此(ci)實驗步驟更快

能夠(gou)在一項檢測(ce)中使(shi)用許多不同(tong)的抗體，從而能夠(gou)同(tong)時(shi)讀(du)取大量(liang)終點

間接：非偶(ou)聯(lian)一抗 + 偶(ou)聯(lian)二抗

可改善以低豐(feng)度(du)存在(zai)的(de)靶標(biao)的(de)檢(jian)測(ce)，同時由于(yu)二次放大(da)可提供更高的(de)靈(ling)敏度(du)（多個二抗(kang)(kang)結合一個一抗(kang)(kang)）

當(dang)直接偶(ou)聯物尚未(wei)獲得時，有(you)益(yi)于(yu)一抗的(de)初(chu)始驗證

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